牛结核病的诊断技术

结核病是由分支杆菌属的结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分支杆菌(M.bovis)和禽分支杆菌(M.avium)引起的一种严重的人兽共患慢性消耗性传染病。除感染人类外，能引起多种哺乳动物和禽类发病。结核分支杆菌、牛分支杆菌和禽分支杆菌，分别主要引起人结核、牛结核和禽结核。牛结核和人结核可以相互感染，禽结核也可以感染牛和人类。牛结核病(Bovine tuberculosis)主要是由牛分支杆菌所引起，在多种组织器官形成干酪样坏死、肉芽肿(结核结节)和钙化结节病变为特征。在家畜中，牛最易感染结核病，特别是奶牛，其次是水牛和黄牛。世界动物卫生组织(OIE)将牛结核病列为B类动物疫病。 
20世纪50年代我国出现了牛结核病的大暴发，如1955年检出阳性率达36.4%，以后由于采取有效措施及长期努力，使结核病阳性率大大降低并控制在较低水平。1985年和1987年两次全国奶牛抽样调查结果显示，牛结核病的患病率分别为5.83%和5.43%。但近年来，随着个体养牛户的增加，结核病的阳性检出率在逐年上升。尤其是2003年广州市某大型奶牛公司下属企业太和镇云燕畜牧发展公司卖结核牛奶事件震惊广东，该奶牛场在630头奶牛有70%患结核病的情况下，每日仍有两吨多病牛奶供应广州市场。 
目前我国一些省区牛结核病的发病率呈现上升趋势，已达到9%甚至更高的阳性检出率。因此，做好牛结核病的定期检测普查工作相当重要。 
1　临床症状和病理变化诊断 
牛结核病临床症状不典型，感染前期不出现临床症状，而感染后期常出现体弱、厌食、消瘦、呼吸困难、淋巴结肿大和咳嗽等，这些症状在其他疾病也可看到，故早期临床诊断不易获得准确结果。病理学检查可以根据特征病变确诊，如干酪样坏死、钙化、上皮样细胞、多核巨细胞和吞噬细胞等，但必须在宰杀后进行。 
2　抗酸染色法 
　　病料涂片后进行抗酸染色，显微镜检查抗酸性杆菌，本菌的细胞壁不仅有肽聚糖，还有特殊的糖脂，因为糖脂的影响，致使革兰氏染色不易着染，但能抵抗30 mL/L酸酒精的脱色作用，抗酸染色为红，常用齐尼二氏(Ziehl-Neelson)染色法，也可用荧光抗酸染色法。如果组织内有抗酸性微生物，并且具有典型的组织学病变，则可以做出初步诊断。抗酸染色法阳性率比较低，但它作为一种传统的检测方法，具有假阳性率低，价格低廉，操作简便等特点，在牛场中就可进行，所以仍有一定的实用价值。 
3　细菌分离培养法 
用选择性培养基分离分支杆菌，再通过培养和生化试验来鉴定，也可采用核酸探针和聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法。如果因培养物污染或其他特殊原因，可通过豚鼠接种，再分离鉴定来证实。常用的培养基是罗杰二氏(Lowenstein-Jensen)培养基、改良罗杰二氏培养基、丙酮酸培养基和小川培养基。但是，在上述培养基中，结核菌需14 h～15 h分裂一次，这使得病原学检查所需周期长，一般需10 d～30 d才能看到菌落，阳性率不高，所以在实际工作中很少被采用。 
4　PCR法 
PCR技术自1983年发明以来，显示出了灵敏度高、特异性强、快速等特点，已经被广泛地用于检测疑似结核病病人的临床样品(主要是痰液)，近年来在检测牛结核病方面也有应用。Ritelli M等报道，将人的一个巨噬细胞系用来从临床样品中分离扩增分支杆菌，收集培养后的细胞，再通过半套式PCR检测培养物中牛分支杆菌的特异性插入序列IS6110，可以确定有没有牛分支杆菌感染。刘思国等根据已经发表的牛分支杆菌的pncA基因序列，设计引物可扩增294 bp目的片段，建立了特异性检测牛分支杆菌的PCR方法，该方法特异性强，敏感度可达到50 pg，阳性样品符合率为90%，阴性样品符合率为100%，而且有利于结果的判定和临床样品的直接检测。 
但是，商品化试剂盒和各科研部门研制的方法检测结果差异较大。含有少量细菌的样品降低了检测结果的可靠性。由于去除污染的方法、DNA提取步骤、去除酶抑制剂技术、内部和外部控制以及交叉污染的防止措施等差异使得结果千差万别。该方法还需要标准化和更加严格的操作步骤，以克服实验过程中容易出现的假阳性或假阴性问题。 
5　迟发性变态反应试验 
　　目前临床上应用最广泛的是迟发性变态反应(delayed type hypersensitivity，DTH)试验，即结核菌素试验(tuberculin test)，它是测定牛结核病的标准方法，也是国际贸易的指定方法。对牛皮内注射结核菌素，并在72 h后测量注射部位肿胀程度。美国就是采用扑杀结核菌素试验阳性牛而消灭了牛结核病。它的技术要求不高，但是工作量大，检出时间长，操作麻烦，许多因素都可以降低该方法的敏感性和特异性。由于提纯结核菌素(PPD)皮肤试验个体差异较大，注射剂量和PPD批号对牛个体反应均有差异，会呈现不同的皮肤反应，其结果以皮肤厚度的增加数为准，易造成人为误差。结核菌素试验阳性仅能表明在过去某一时间曾经发生过的一次结核菌感染，它无法证明目前的结核菌感染是否为活动的，或仅为在机体的某处有活的结核菌存在。当动物发生某些细菌或病毒的感染时，或者使用某些药物治疗及一些不明原因，也可能造成假阳性或假阴性结果。部分研究者还发现，该法存在着极强的非特异性，即在相当数量的结核菌素试验阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核菌，或仅仅分离出非典型的分支杆菌，重复检疫时阳性率下降，而且妊娠母牛检出率低，给基层的扑杀工作带来困难，因此在实际工作中用于诊断牛结核病并不十分理想。 
6　血清学方法 
　　细胞免疫随病情加重而减弱，体液免疫随病情加重而增强。结核菌是典型的胞内寄生菌，尤其是在巨噬细胞内。对结核菌的免疫，首先是细胞免疫，其次才是体液免疫，二者是分离的。所以反映细胞免疫强弱的迟发性变态反应，不能检出所有的结核病牛，仅以此法检测牛结核病显然是不准确的。研究认为，结核病牛血清抗体IgG与正常水平差异显著，从理论上阐明了检出血清中抗体以诊断疾病的可能性。结核菌的IgG抗体的血清水平与病变程度呈正相关，因此检测血清中IgG抗体的水平对于疾病的诊断有重要意义。细胞免疫是主要的免疫方式，PPD是检测细胞免疫，血清学方法是检测体液免疫，所以PPD的检出率要高于血清学方法。但是，PPD阳性不能全部包括所有抗体阳性，且PPD阳性牛，也未必有临床表现，而抗体阳性往往意味着病情正在恶化，正是危险的传染源，所以从这方面来看，血清学方法比PPD检测更重要。另外，非典型分支杆菌感染及某些寄生虫病等非特异性因素的干扰，均可引起牛的迟发性变态反应阳性，而体液免疫的水平却很低，这样就使得血清学方法更容易排除假阳性。 但牛分支杆菌与其他许多分支杆菌具有类属的抗原性，因此常出现假阳性反应而干扰牛结核抗体的检测。血清学检测中比较新的检测方法为胶体金试纸条检测，应用免疫层析原理。 
7　淋巴细胞转化试验 
　　淋巴细胞转化试验(transformation test of lymphocytes)是测定全血样品对结核菌素PPD抗原细胞反应性。但是这种方法需要从全血中分离淋巴细胞，需要在复合物组织培养介质中培养这些细胞3 d～5 d，需要用放射核酸技术检测细胞增殖水平。因为试验耗时而且前期准备以及试验操作都比较复杂，如需要较长的孵育期和要使用放射性核苷酸，所以在常规的牛结核病诊断中并不被采用，而仅仅用于野生动物以及动物园动物的检测。 
8 　γ-干扰素试验 
　　γ-干扰素试验(γ-interferon assay)是测定全血培养系统中淋巴因子的释放，在有特异性抗原培育16 h～24 h的培育期间内，致敏淋巴细胞释放出γ-干扰素。牛γ-干扰素的定量测定是用对γ-干扰素的两种Mab，做夹心ELISA。这种方法的敏感性和特异性较高，能鉴别出早期感染牛分支杆菌的牛，降低了传染的风险，而且Ryan T J等报道，结核菌素试验后的8 d～28 d进行γ-干扰素试验，对其灵敏度和特异性没有显著影响。但是成本也高，并且收集血样后试验必须在8 h内进行。所以这种方法不适合于临床牛结核病的检测。 
9　菌体成分检测法 利用薄层层析技术(thin-layer chromatography，TLC)，通过分析牛分支杆菌的脂质成分PGL(phenolic glycolipid)与PDIM(phthiocerol dimycocerosate)，可以快速的检测和鉴定牛分支杆菌，仅需10 mg～15 mg的细菌培养物即可，具有简便、快速的优点，可以成为传统生化鉴定的替代方法。